Met bacteriologisch onderzoek klaar voor de toekomst!

Monsters, verzameld vanuit het veld en/of sectiezaal, worden in het eigen laboratorium ingezet voor algemeen eenvoudig bacteriologisch onderzoek. Dit houdt in dat het materiaal ingezet wordt op een bloedagarplaat (universele plaat) om na 24 uur bij 37°C eventuele groei te beoordelen. Is er groei dan willen we graag weten met welke bacterie we te maken hebben (determiniatie). Determinatie vindt plaats door allerlei testjes uit te voeren om te achterhalen om welke bacterie het hier gaat, zoals een gram kleuring, oxidase test, katalase test, coagulase test etcetera. Bij bijvoorbeeld de katalase test wordt er gekeken of de bacterie in staat is om waterstofperoxide om te zetten in water en zuurstof. Hierdoor zien we gasbelletjes en is de betreffende bacterie katalase positief.  Elke bacterie is in staat om verschillende biochemische reacties uit te voeren waardoor we hem kunnen onderscheiden. Op deze manier kunnen we onderscheid maken op bacteriegroep (geslacht) tussen coliformen (waaronder de E.coli valt), Staphylococcen, Streptococcen/Enterococcen, Pasteurella etc.. Wil men echter weten om bv. welke soort Streptococ of Enterococ het gaat zijn we genoodzaakt een bonte rij in te zetten of deze door te sturen naar een extern laboratorium voor verdere typering (bv. door de Maldi-Tof).

Is de bacterie bekend, dan kunnen we vervolgens bepalen voor welke antibiotica deze bacterie gevoelig of ongevoelig is. Dit om, als het noodzakelijk is om het pluimvee te behandelen, een goede keuze te kunnen maken. De gevoeligheid van een antibiotica wordt bepaald door de diskdiffusie methode. Hiervoor wordt de betreffende bacterie op een daarvoor geschikte agar plaat geënt. Op deze plaat worden “paperdisks” met antibiotica gelegd en vervolgens wordt de plaat 18-24 uur bebroed bij 37°C. De antibiotica diffundeert door de agar plaat en de bacterie groeit. Is de bacterie gevoelig voor een bepaald antibiotica, dan zal deze niet groeien rondom het schijfje (remmingszone). Is hij ongevoelig, dan zal hij doorgroeien tot aan het schijfje. Met een schuifmaat worden na de incubatie tijd de remmingszone gemeten (mm) en aan de hand van vastgelegde criteria wordt de bacteriegevoeligheid afgegeven met gevoelig (+), intermediair gevoelig (+/-) of ongevoelig (-).

Bovenstaande methode wordt al meer dan 50 jaar op deze manier uitgevoerd. Een prima methode met veel handwerk waarbij de nauwkeurigheid van aflezen/uitvoeren afhankelijk is van de nauwkeurigheid van de analist.

Is dit niet te automatiseren?

Ja zeker, het determineren van de bacteriën wordt veelal uitgevoerd door de Maldi-Tof, een apparaat wat van de bacterie een massaspectrum maakt, een soort vingerafdruk op basis van eiwitten. Door deze te vergelijken met reeds bestaande vingerafdrukken in een database, is men in staat om heel snel bacteriën te determineren. Vervolgens kan men een gevoeligheid maken door het bepalen van de MIC waarde (Minimale Inhiberende Concentratie) uit een verdunningsreeks, de laagste concentratie van een antibioticum waarbij de groei van de bacterie wordt geremd.

Bovenstaande wordt veelal gebruikt in de humane laboratoria en de grotere veterinaire laboratoria. Deze laboratoria hebben vaak de middelen (aantallen monsters en financieel) om snel en zorgvuldig een grootte database op te zetten. Toch zien we ook binnen de pluimveesector dat het steeds belangrijker wordt om goed en gedegen bacteriologisch onderzoek uit te voeren, enerzijds in ons streven naar reductie van het antibiotica gebruik en anderzijds om antibiotica nog specifieker in te kunnen zetten.

Poultry Vets kan dan ook met gepaste trots melden dat ze sinds 1 april het eerste veterinaire laboratorium in Nederland is met een VITEK. Een apparaat dat in staat is om bacteriën te identificeren (determinatie) en dat van dezelfde bacterie ook een gevoeligheid kan onderzoeken op basis van MIC -waarden. De VITEK wordt met name voor het bepalen van gevoeligheden gebruikt in ziekenhuizen. In het buitenland (o.a. Engeland) wordt de VITEK wel al veterinair ingezet. Sinds enige tijd is er dan ook de beschikking over veterinaire panels voor het bepalen van gevoeligheden bij landbouwhuisdieren en gezelschapsdieren.

Sinds 1 april wordt de VITEK door Poultry Vets ingezet. De voorbewerking is identiek als vanouds, monsters verzameld vanuit het veld en/of sectiezaal worden ingezet op een bloedagarplaat en in dit geval ook op een MacConkey plaat voor de groei van gram negatieve bacteriën. Na 24 uur incubatie wordt van de specifieke bacteriën een suspensie gemaakt die vervolgens met het juiste panel in de VITEK wordt gezet. Eén panel voor de identificatie en één voor de gevoeligheid. Het identificatie panel bevat een scala aan chemische testen die op basis van kleuromslagen met verschillende golflengtes gemeten worden. Het gevoeligheids panel bevat diverse concentraties antibiotica waarbij bepaald wordt of er troebeling (groei) plaats vindt.

De VITEK kamer wordt onder vacuum gezet waardoor via het rietje het panel volledig gevuld wordt. Vervolgens wordt dit rietje gesealed zodat contaminatie uitgesloten is. De VITEK plaatst het panel automatisch in de broedkamer waar het incuberen start, elke 15 minuten wordt er één panel voor een optisch meetinstrument geschoven waar elk welletje meerdere malen gemeten wordt (hoeveelheid licht dat wordt doorgelaten). Zodra de metingen niet meer veranderen wordt er in de database gezocht naar de bacterie die past bij het gemeten biochemisch patroon. Voor de gevoeligheid worden de MIC-waarden weergegeven en vergeleken met in de database bekende breekpunten voor die bacterie bij dat specifiek antibiotica. Bijvoorbeeld, de gemeten MIC waarden voor ampicilline voor een E.coli is 4 µg/ml – vergelijken we dit met de (EUCAST) breekpunten die in de database voor ampicilline en E.coli zijn vastgelegd, betekent het dat deze E.coli ongevoelig is voor ampicillline.

De VITEK kan continue gevuld worden tot een max. van 60 monsters, dus gedurende de dag kunnen er monsters bijgeplaatst worden. Verder draait de VITEK ook nadat de analist al naar huis is gewoon door. De doorlooptijd is afhankelijk van de bacteriesoort, de identificatie van bv. een E.coli is binnen enkele uren beschikbaar, voor de gevoeligheid zijn minimaal 8 uur tot 24 uur nodig.

Met de VITEK is Poultry Vets in staat om niet alleen bacteriën op geslacht maar ook op soort te identificeren. Daarnaast is de MIC waarden bepaling een kwantitatieve en daarmee een nauwkeurigere methode dan de disk-diffusie methode. Niet voor niets wordt de MIC-methode internationaal gezien als de “gouden standaard”.

De manier van rapporteren in gevoelig, intermediair en ongevoelig blijft hetzelfde. Echter op de achtergrond is er nog meer informatie beschikbaar omtrent mn. de gevoeligheid van bacteriën voor specifieke antibiotica.

Met de VITEK is Poultry Vets klaar voor de toekomst!